Resumen

La articulación temporomandibular (ATM), articulación entre el cóndilo mandibular y el hueso temporal, se divide en dos compartimentos (superior e inferior) por un disco fibrocartilaginoso. El disco de la ATM consiste en un tejido avascular y no inervado, con un comportamiento viscoelástico. Mecánicamente, el disco de la ATM experimenta fuerzas de tracción, compresión y corte. El desplazamiento o la degeneración del disco de la ATM podrían llevar a trastornos temporomandibulares intraarticulares (TMD) severos. A pesar del gran número de terapias/tratamientos actuales, hay opciones de tratamiento limitadas para el TMD intraarticular severo. Una estrategia para resolver este problema podría ser el uso de un material de interposición para sustituir el disco dañado de la ATM, que se degradará gradualmente y dará lugar a nuevo tejido. En este trabajo se utilizaron y probaron tres opciones, una utilizando un material termoplástico, poli(ε-caprolactona) (PCL), otra utilizando un hidrogel fotopolimerizado, diacrilato de polietileno glicol (PEGDA) y la tercera utilizando la combinación de los dos materiales. Los resultados obtenidos demostraron que la combinación de diferentes materiales podría representar una ventaja significativa en la ingeniería de tejidos del disco de la ATM y en la ingeniería de tejidos del cartílago en general.

Introducción

La articulación temporomandibular (ATM) es una articulación bilateral entre el proceso condilar de la mandíbula y la fosa mandibular y el tubérculo articular del hueso temporal. Un disco fibrocartilaginoso se interpone entre las estructuras óseas unidas a la cápsula fibrosa en su margen, que divide la articulación en dos cavidades: superior e inferior.

El disco de la ATM consiste en un tejido fibrocartilaginoso avascular y no inervado, con un comportamiento viscoelástico. El disco presenta una forma elíptica, más largo en la dirección mediolateral que en la dirección anteroposterior (19 y 13 mm respectivamente, en humanos). Anatómicamente, el disco de la ATM se puede dividir en tres regiones: banda anterior, zona intermedia y banda posterior. La zona intermedia es considerablemente más delgada que las bandas (≈1 mm, en humanos), y la banda posterior es la región más gruesa del disco (≈4 mm, en humanos). La mayor parte del disco de la ATM está compuesta de agua (≈73 %). Aparte del agua, el disco de la ATM está compuesto de células (fibroblastos, fibrocitos y células similares a condrocitos, con forma redondeada) y una matriz extracelular (MEC) de fibras de colágeno denso (≈80 % por peso seco), fibras elásticas (≈2 %) y glicosaminoglicanos.

Esta forma biconcava se adapta a la anatomía ósea de la articulación y es esencial para las funciones de la ATM. Al igual que en otras articulaciones, el disco de la ATM reduce la fricción en la articulación y distribuye la carga intraarticular. Además, ayuda en la alineación y estabilización de la articulación durante la rotación y la translación debido a cierta flexibilidad proporcionada por la región intermedia. El disco de la ATM tiene un comportamiento viscoelástico y experimenta fuerzas de tracción, compresión y corte. Las propiedades de compresión reportadas del disco de la ATM son altamente inconsistentes, variando desde decenas hasta decenas de miles de kPa. En cuanto a las diferentes regiones, las bandas anterior y posterior parecen tener propiedades de compresión más altas que la zona intermedia.

La degeneración y el desplazamiento del disco de la ATM pueden llevar a trastornos de la ATM (TMD). Se estima que el 25% de la población puede experimentar síntomas de TMD, tales como: dolor en la articulación y en los músculos circundantes; chasquidos; incomodidad al mover la mandíbula; bruxismo. La mayoría de los TMD se tratan con éxito con tratamientos no invasivos (por ejemplo: fisioterapia, férulas/ajustes oclusales y farmacología), pero, en algunos casos, es necesario recurrir a la cirugía (por ejemplo: artrocentesis, artroscopia, discopéxia, discectomía y reemplazo total de la articulación).

La anatomía equivalente a la ATM humana ha sido estudiada en diferentes animales. Algunos de los modelos más comunes incluyen cerdo, oveja, cabra, vaca, perro, rata y conejo. En este trabajo, la geometría de los implantes del disco de la ATM se obtuvo mediante ingeniería inversa del disco de la ATM de ovejas Black Merino (Ovies aries).

En las últimas dos décadas, el campo de la Ingeniería de Tejidos del disco de la ATM (TE) ha estado creciendo como una solución prometedora para los TMD, con el objetivo de la reparación y regeneración del disco. Se han desarrollado diferentes enfoques, utilizando o no andamios, una variedad de materiales diferentes y la inclusión de algunos factores de crecimiento.

Los andamios utilizados en la TE del disco de la ATM se han producido en poliamida, ácido poliglicólico (PGA), poli(glicerol sebacato) (PGS), ácido poliláctico (PLA), ácido poliláctico-L (PLLA), politetrafluoroetileno (PTFE) y otros biomateriales naturales, como hidrogeles de colágeno y de discos de ATM de cerdo descelularizados. En los últimos años, debido a su lenta tasa de degradación, los andamios y espumas de poli(ɛ-caprolactona) (PCL) han sido ampliamente investigados, considerando la lenta tasa de regeneración del fibrocartílago.

Este trabajo se centra en el desarrollo de un andamio basado en PCL y PEGDA para un implante de disco bioingenierizado de la ATM, con propiedades cercanas al tejido nativo, producido con técnicas de prototipado rápido y un enfoque quirúrgico factible.

Materiales y Métodos

Se produjeron diferentes andamios utilizando técnicas de ingeniería inversa y fabricación aditiva, con el fin de reemplazar y promover la regeneración de la ECM del disco de la ATM. En esta investigación se produjeron tres tipos de matrices 3D: i) hidrogel de PEGDA a través de fotopolimerización, ii) andamios de PCL utilizando modelado por deposición fundida (FDM), iii) combinación de ambos.

Producción de andamios de poli (ɛ-caprolactona)

La poli (ɛ-caprolactona) (PCL) es un poliéster biocompatible y biodegradable (12-24 meses), que ha demostrado ser capaz de soportar una amplia variedad de tipos de células y es un material aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). El proceso de extrusión o modelado por deposición fundida (FDM) consiste en la extrusión de un (termo)plástico o cera, en este caso PCL (como filamento o pellets), a través de una boquilla que construye la capa deseada capa por capa. Se utilizan calentadores resistivos que cubren el canal de suministro y la boquilla para mantener el material justo por encima de su punto de fusión (alrededor de 60ºC para PCL). Esto permite que el material fluya fácilmente a través de la boquilla, uniéndose a la capa inferior y logrando una solidificación rápida.

En el primer experimento, se investigó la influencia de la temperatura de la boquilla en el comportamiento mecánico de los andamios. Así, se produjeron andamios de PCL 6500 (Perstorp) (n=4) utilizando la máquina BioExtruder (CDRSP, Leiria, Portugal) con una temperatura de boquilla de 80ºC (grupo T80) y 86ºC (grupo T60). Además, las temperaturas del sistema de depósito y de corredor/puente eran, respectivamente, 80ºC y 100ºC, la boquilla utilizada tenía un diámetro de 300 μm y las velocidades de deposición y de la cabeza transversal eran de 14.5 rpm y 10 mm∙s^-1, respectivamente. Los andamios finales de PCL, cuya geometría se obtuvo mediante ingeniería inversa de un disco de ATM de oveja, tenían una base de 278 ± 2 mm² y un grosor de corte de 280 μm.

Producción de hidrogeles de PEGDA

El polietilenglicol, PEG, es una cadena de polímero biocompatible, hidrofílica, neutra y altamente móvil que se ha utilizado en la TE de hueso y cartílago, entre otras aplicaciones biomédicas, como sistemas de liberación controlada de fármacos. El diacrilato de polietilenglicol, PEGDA, es un derivado de PEG que se manipula fácilmente en hidrogeles a través de fotopolimerización utilizando fotoiniciadores biocompatibles, como DMPA (2,2-Dimetoxi-2-fenil-acetofenona), y exposición a luz UV de longitud de onda larga, induciendo el entrecruzamiento.

Los hidrogeles de PEGDA (Sigma-Aldrich) (n=4) se produjeron con dos concentraciones diferentes, 20% (grupo H20) y 30%w/V (grupo H30), con un buffer de ácido 2-[4-(2-hidroxietilo) piperazina-1-il]etano sulfonico (HEPES) (Sigma-Aldrich). La fotopolimerización se indujo utilizando un fotoiniciador de 0.1% w/V 2,2-dimetoxi-1,2-difeniletanona (DMPA, Sigma-Aldrich) con exposición a luz UV (365 nm). Se obtuvo una forma adecuada del disco de la ATM mediante el uso de una herramienta de corte creada exclusivamente para este propósito.

Tratamiento de superficie

Con el fin de mejorar la hidrofobicidad de los andamios de PCL, se realizaron dos estrategias principales: i) 4 andamios (del grupo T86) se colocaron en una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1M durante aproximadamente 24 horas (PNaOH); ii) otros 4 andamios (del grupo T80) se colocaron en una solución de PEGDA antes de la fotopolimerización (PH).

Pruebas mecánicas

El comportamiento mecánico de los andamios y los hidrogeles se evaluó mediante pruebas de compresión uniaxial no confinada utilizando una máquina de ensayo universal con una tasa de extensión de 1 mm.min^-1. Antes de las pruebas mecánicas, se determinó el área de cada andamio utilizando el software ImageJ2. La fuerza, F (N) y la deformación (mm) se registraron en cualquier momento durante las pruebas y se determinaron los valores de tensión de compresión y deformación para trazar los gráficos de tensión-deformación. Así, se estimó el módulo de compresión elástico de acuerdo con la pendiente de la región lineal inicial de las curvas trazadas.

Análisis estadístico

Se determinaron estadísticas descriptivas univariantes (media y desviación estándar) del comportamiento mecánico para cada grupo. Las diferencias significativas entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía. Se realizaron pruebas post-hoc (prueba de Tukey) para identificar diferencias significativas (p<0.05) para diferentes temperaturas de boquilla durante la producción y para el tratamiento superficial, en andamios, y para las diferentes concentraciones de PEGDA en el caso de los hidrogeles. Estas pruebas se realizaron en GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.) y Excel 2016 (Microsoft Corporation). Se utilizó ImageJ2 (dominio público) para determinar las áreas de andamios e hidrogeles.

Resultados y Discusión

Usando el Bioextrusor, somos capaces de producir con éxito andamios reproducibles (26 x 13 x 4 mm máximo) con la geometría deseada obtenida a través del uso de la ingeniería inversa de un disco nativo (Fig. 1).

**Fig. 1** Ejemplo de un andamio de disco TMJ: (A) vista superior de un andamio; (B) vista inferior de un andamio. La barra de escala es equivalente a 10 mm.

Evaluación de la influencia de la temperatura de la boquilla

Los andamios de disco de TMJ de PCL se obtuvieron con éxito utilizando las dos temperaturas de boquilla distintas. Los resultados obtenidos a través de pruebas de compresión uniaxial no confinada indican que hay diferencias significativas entre los dos grupos (p<0.05) (ver Fig. 3). Los grupos T80 y T86 presentaron un módulo de compresión de 31.8 ± 1.5 MPa y 23.9 ± 1.8 MPa, respectivamente.

**Fig. 3.** (A) Región inicial de las curvas de tensión-deformación de compresión de todos los andamios de PCL (un ejemplo por grupo). Las curvas T80 y T86 son casi superponibles; (B) Comparación de los módulos de compresión (E, MPa) de los diferentes grupos de andamios de PCL, producidos bajo diferentes condiciones.

Según la literatura, la temperatura influye directamente en el ancho de la carretera, influyendo en la porosidad final (una temperatura más alta conduce a una menor porosidad) de las estructuras y, en consecuencia, en su comportamiento mecánico. Una temperatura más baja permite que el material se solidifique más rápido, reduciendo posibles cambios en la geometría de los andamios. Estos cambios pueden ocurrir a temperaturas de producción más altas porque el material, al estar en un estado viscoso, se ve afectado por la gravedad y los andamios se vuelven ligeramente planos. Este experimento está en concordancia con el resultado esperado.

Evaluación de la influencia de la concentración de PEGDA en las propiedades mecánicas de los hidrogeles

Como se muestra en la figura 2, se presentan diferencias significativas entre los dos grupos de hidrogeles (p<0.05). Los hidrogeles producidos con una concentración de PEGDA del 20% w/V presentaron casi la mitad del módulo de compresión y un tercio de la resistencia última (1.30 ± 0.15 MPa y 0.30 ± 0.03 MPa, respectivamente) en comparación con los hidrogeles producidos con 30% w/V de PEGDA (2.21 ± 0.16 MPa y 1.01 ± 0.11 MPa). A pesar de eso, los hidrogeles del grupo H30 demostraron ser altamente frágiles al doblarse o estirarse. Así, para producir los andamios del grupo PH, se utilizaron hidrogeles similares a los del grupo P20.

**Fig. 2.** (A) Región inicial de las curvas de esfuerzo-deformación por compresión de los dos tipos de hidrogeles (un ejemplo por grupo).; (B) Comparación de los módulos de compresión (E, MPa) de los diferentes grupos de hidrogeles de PCL, producidos con diferentes concentraciones de PEGDA.

Influencia del tratamiento de superficie

El tratamiento de superficie de los andamios de PCL no condujo a diferencias significativas en el comportamiento mecánico de los andamios. El módulo de compresión del grupo PNaOH (21.2 ± 2.2 MPa) disminuyó ligeramente en comparación con el grupo de control (T86), pero estas diferencias no fueron significativas (p>0.05). La ligera disminución en las propiedades mecánicas se debe a la degradación superficial promovida por la solución de NaOH - disminución en el diámetro de los filamentos volviéndose irregulares a lo largo de la fibra. Así, los andamios pierden masa y su porosidad aumenta, lo que lleva a una disminución de sus propiedades mecánicas a compresión.

Por otro lado, la adición de hidrogel en el grupo PH no causó diferencias significativas en los módulos elásticos de compresión (31.4 ± 1.4 MPa) en comparación con el grupo de control (T80). Además, el hidrogel parece aumentar significativamente la lubricación y flexibilidad de los andamios y podría ayudar en la adhesión celular, debido al aumento de su hidrofobicidad.

El uso de PCL en la TE de cartílago, específicamente en el tejido fibrocartilaginoso del disco de la ATM, es reciente. Aunque la hidrofobicidad original del PCL, el tratamiento de superficie con NaOH puede mejorar su hidrofiliacidad y adhesión celular debido a la irregularidad de la superficie. Además, la incorporación de hidrogel de PEGDA es un enfoque vanguardista y podría señalar la dirección correcta para un implante de disco bioingeniería de la ATM exitoso. La combinación de dos biomateriales diferentes (y las tecnologías de producción asociadas) puede resultar en beneficios significativos en la TE del disco de la ATM. En este enfoque, el PCL proporciona la resistencia mecánica necesaria y su tasa de degradación lenta es compatible con la tasa de crecimiento lento del tejido fibrocartilaginoso, mientras que el hidrogel de PEGDA promueve la adhesión celular, aumenta la lubricación del implante y permite la integración de factores de crecimiento. Aunque el PCL presenta una rigidez mayor que el tejido nativo del disco de la ATM, esto podría ser beneficioso en cirugía, ya que permite una colocación más fácil del implante, reduciendo el tiempo y permitiendo una cirugía menos invasiva.

Conclusión

El disco de la ATM TE tiene como objetivo ofrecer una alternativa a los tratamientos actuales de TMD debido a la degeneración del disco. Así, combinando diferentes materiales es posible producir un implante bioingeniería que imite mejor las propiedades del tejido nativo.

En este estudio, producimos con éxito un andamiaje basado en PCL y PEGDA para el implante de disco bioingeniería de la ATM. Debido a la lenta tasa de degradación del PCL, este material es compatible con la lenta tasa de crecimiento del tejido del disco de la ATM. Además, el PCL proporciona importantes propiedades mecánicas al andamiaje y su relativa rigidez podría representar una ventaja durante la cirugía. Por otro lado, el hidrogel de PEGDA promueve la adhesión celular y proporciona lubricación. Así, las funciones del disco de la ATM están aseguradas: i) la lubricación permite una reducción de la fricción en la articulación; ii) la distribución de la carga intraarticular está asegurada por la geometría del andamiaje y por las propiedades mecánicas de los materiales; ii) la geometría del implante permite la alineación y estabilización de la articulación.

En resumen, este trabajo demostró que la combinación de diferentes materiales podría representar un avance significativo en la ingeniería de tejidos del disco de la articulación temporomandibular (ATM) y en la ingeniería de tejidos del cartílago en general.

Autores: Luís Francisco, Carla Moura, Tânia Viana, David Ângelo, Pedro Morouço, Nuno Alves

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