Creación de grupos experimentales bien equilibrados para estudios comparativos de endodoncia: una nueva propuesta basada en micro-CT y métodos in silico

Resumen

Objetivo: Introducir un nuevo método para seleccionar dientes anatómicamente coincidentes utilizando tecnología de microtomografía computarizada (micro-CT).

Metodología: Se seleccionaron incisivos mandibulares de raíz simple con un solo conducto radicular (n = 60) y se distribuyeron en tres grupos experimentales según el método utilizado para emparejar 10 pares de dientes en cada grupo. En el grupo 1, los pares de incisivos mandibulares se seleccionaron al azar de un grupo de dientes. En el grupo 2, los dientes se emparejaron en función de la medición del ancho del conducto a 5 mm del ápice radicular utilizando radiografías tomadas desde direcciones bucolinguales y mesiodistales. En el grupo 3, los dientes se escanearon (tamaño de píxel de 14.25 lm) y se emparejaron en función de los aspectos anatómicos del conducto radicular, denominados relación de aspecto (AR), volumen y geometría tridimensional del conducto. Después de asignar los especímenes a los grupos 1 y 2, los dientes se escanearon y se evaluó la morfología del conducto como en el grupo 3. Se realizó un análisis de regresión bivariada de Pearson correlacionando los valores individuales de AR de cada par, y se utilizó el coeficiente de correlación para estimar la fuerza del proceso de emparejamiento. Se aplicaron pruebas post hoc de Tukey de ANOVA de una vía para comparaciones por pares a un nivel de significancia del 5%.

Resultados: La micro-CT reveló que el 100% de las muestras tenía correlaciones fuertes (80%) o muy fuertes (20%) con respecto a los valores de AR. El análisis del método radiográfico reveló una fuerte correlación en dos pares (20%), pero la mayoría de las muestras tenía coeficientes de correlación débiles (30%) o negligibles (30%). El método de aleatorización resultó en tres pares (30%) con correlaciones muy fuertes, mientras que el 50% tenía tasas débiles o negligibles. Se observó una diferencia significativa en los coeficientes de correlación en el método de micro-CT en comparación con los otros grupos (P < 0.05), mientras que no se detectó diferencia entre los métodos radiográfico y aleatorizado (P > 0.05). Los cálculos de eta-cuadrado (g2) demostraron un tamaño del efecto muy alto en el grupo de micro-CT para la selección de pares (0.99) y tamaños del efecto más bajos en los grupos radiográfico (0.67) y aleatorizado (0.66).

Conclusiones: El método de micro-CT fue capaz de proporcionar un mejor control del efecto de confusión que las variaciones anatómicas en la morfología dental pueden tener sobre los resultados en experimentos con diseño de pares emparejados.

Introducción

Las pruebas experimentales de banco se han utilizado a menudo para evaluar y clasificar la calidad de una plétora de materiales y técnicas relacionadas con el modelado de conductos radiculares, la irrigación, la desinfección y los procedimientos de obturación (Buck et al. 1999, Eldeniz & Ørstavik 2009, Çapar et al. 2014, Passalidou et al. 2018). Sin embargo, los resultados y conclusiones de algunos de estos estudios comparativos pueden no ser confiables debido a una falta general de coincidencia anatómica de los dientes antes de la experimentación (De-Deus 2012). Esta falta de estandarización revela una validez interna inconsistente y deficiente de estos estudios, lo que está en línea con la afirmación de Babb et al. (2009): ‘Aunque los diseños de pruebas que utilizan espacios de conductos naturales tienen un atractivo pragmático para los clínicos, tienen severas limitaciones desde una perspectiva de ciencia de materiales’. De hecho, la dificultad de crear una línea base confiable utilizando dientes naturales extraídos es una consecuencia de la intrincada anatomía del sistema de conductos radiculares, que es un factor de confusión decisivo.

En general, los grupos experimentales en estudios comparativos se han creado seleccionando dientes de una o múltiples raíces de forma aleatoria con un tamaño de muestra limitado (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019). En la práctica, esto significa una estandarización muy pobre y la incapacidad de asegurar la comparabilidad experimental, ya que puede dar lugar a grupos experimentales con grandes variaciones en la línea base del sustrato (Smith & Steiman 1994, També et al. 2014). En consecuencia, estos estudios pueden haberse llevado a cabo bajo condiciones experimentales disímiles y los resultados pueden revelar el efecto de la anatomía del conducto radicular en lugar de la variable de interés, que son los materiales, técnicas y/o instrumentos en comparación (De-Deus 2012). Para superar este problema y optimizar el diseño experimental, el emparejamiento anatómico de la morfología del conducto radicular debe considerarse como un primer paso experimental subyacente de cualquier estudio comparativo ex vivo en endodoncia. Esto proporcionará una línea base consistente y una mejora de la validez interna general del estudio. Por lo tanto, varios estudios intentaron superar el factor anatómico utilizando el examen visual de radiografías tomadas en diferentes angulaciones (Yared & Bou Dagher 1994, Bürklein & Schäfer 2012) al asignar los dientes a grupos experimentales de acuerdo con el ancho del conducto radicular medido a cierta distancia del ápice radicular (Ruckman et al. 2013). Sin embargo, la calidad general de este enfoque metodológico no está basada en evidencia. Se puede especular que esto está lejos de ser ideal, considerando las bien conocidas variaciones de la forma del canal a lo largo de la raíz (Versiani et al. 2012, 2016a). Otro enfoque sugiere el uso de dientes contralaterales (Johnsen et al. 2017), que han demostrado tener una anatomía similar (Zehnder et al. 2006, Mitchell et al. 2011, Iriboz et al. 2015, Viapiana et al. 2016, Guimaraes et al. 2017). A través del uso de tecnología de imagen de tomografía computarizada micro (micro-CT), se demostró que los premolares contralaterales exhiben un alto grado de simetría de coincidencia y se desarrolló un método de simulación por computadora válido y confiable (in silico) para emparejar premolares contralaterales en estudios comparativos endodónticos experimentales (Johnsen et al. 2016, 2017, 2018). Sin embargo, estos hallazgos no excluyeron el uso de otros tipos de dientes, sino que sugirieron que sería concebible emparejar dientes de diferentes individuos si están dentro de un cierto rango de similitud morfológica (Johnsen et al. 2016). El rango, o el coeficiente de similitud más bajo aceptable, dependería sin duda de una validación adicional y aún no se ha determinado. Así, este tipo de repositorio de base de datos de espacios pulpares no contralaterales abriría la puerta a estudios extremadamente selectivos, así como a estudios eficientes en tiempo y costo.

El propósito del presente estudio fue introducir una nueva metodología para emparejar incisivos mandibulares no contralaterales en grupos experimentales basados en su morfología interna a través del uso de tecnología de imágenes de micro-CT. Esta propuesta tiene como objetivo mejorar la validez interna de los estudios comparativos en endodoncia mediante la creación de grupos experimentales anatómicamente bien equilibrados en comparación con los métodos convencionales basados en la aleatorización o el examen radiográfico. Para confirmar la similitud anatómica de los dientes, los datos obtenidos fueron examinados con especial énfasis en la relación de aspecto (AR) del canal a lo largo de toda la longitud de la raíz. Este parámetro puede considerarse como un indicador de similitud morfológica entre diferentes dientes. Además, se abordaron cuidadosamente las ventajas y limitaciones de esta nueva propuesta. La hipótesis nula probada fue que no habría diferencia en los coeficientes de correlación entre los tres métodos probados.

Materiales y métodos

Cálculo del tamaño de la muestra

Basado en los resultados de Versiani et al. (2013a), se ha estimado un tamaño del efecto de 0.7 para el método de selección que produzca muestras anatómicamente emparejadas adecuadamente utilizando tecnología de micro-CT. Este valor se introdujo en una familia de pruebas t-test, método de correlación bi-serial en G*Power para Mac 3.1 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Alemania), junto con un error tipo alfa de 0.5 y una potencia beta del 95%. El software indicó un número de 16 muestras (ocho pares) por grupo para observar un efecto significativo de los criterios de selección utilizando micro-CT sobre métodos convencionales basados en aleatorización o examen radiográfico.

Selección de muestras y grupos

Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional local (protocolo 87450517.5.0000.5243). Un total de 1708 incisivos mandibulares de raíz simple que habían sido almacenados durante los últimos 4 años en un banco de dientes del Departamento de Endodoncia, Universidad Federal Fluminense, Niterói, Río de Janeiro, Brasil, estaban disponibles para este experimento. Los criterios de inclusión comprendieron solo dientes que no mostraran fractura radicular, calcificación, caries, reabsorción o formación incompleta de la raíz. A partir de este conjunto de dientes, se crearon tres grupos experimentales de acuerdo con los siguientes métodos.

Grupo 1 – Método aleatorio (n = 20)

De un grupo de los primeros 76 incisivos mandibulares reunidos aleatoriamente de la muestra original (n = 1708), fue posible recolectar 20 dientes con una longitud de 20 ± 1 mm (desde el borde incisal hasta el ápice anatómico) y distribuirlos aleatoriamente en dos subgrupos (n = 10) con la ayuda de un algoritmo informático (http://www.random.org).

Grupo 2 – Método radiográfico (n = 20)

De 100 incisivos mandibulares adicionales reunidos aleatoriamente de la muestra original (n = 1708), fue posible seleccionar 10 pares de dientes con un ancho de canal similar medido a 5 mm del ápice anatómico (software FIJI/ImageJ v.1.51n; Fiji, Madison, WI, EE. UU.) utilizando proyecciones radiográficas digitales (sistema radiográfico digital Schick CDR; Dentsply Sirona, Charlotte, NC, EE. UU.) tomadas desde las direcciones bucolingual y mesiodistal de cada espécimen.

Grupo 3 – Método Micro-CT (n = 20)

Doscientos cincuenta y un incisivos mandibulares (n = 251) reunidos aleatoriamente de la muestra original (n = 1708) fueron necesarios para crear dos grupos emparejados anatómicamente (n = 10) basados en un enfoque de micro-CT. Así, 251 especímenes fueron escaneados (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Bélgica; 70 kV, 114 mA, tamaño de píxel de 14.25 lm, rotación de 360° con un paso de rotación de 0.5°, promedio de cinco cuadros, utilizando un filtro de aluminio de 1.0 mm de grosor) y reconstruidos en secciones transversales axiales (software NRecon v.1.7.16; Bruker microCT) con parámetros individualizados para la corrección de artefactos de anillo (3–4), límites de contraste (0–0.05) y corrección de endurecimiento del haz (30–45%), resultando en 700–900 imágenes de secciones transversales en escala de grises por diente desde la unión cemento-esmalte hasta el ápice. Luego, las imágenes seccionadas fueron segmentadas para identificar la configuración del conducto radicular (Figura 1a) utilizando una rutina automática en el software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji). En resumen, se utilizó un filtro de medios no locales (Buades et al. 2011) para reducir el ruido mientras se preservaban los bordes del objeto (Figura 1b), seguido de la aplicación del algoritmo basado en Otsu (Otsu 1979) para la binarización (Figura 1c). Para segmentar el conducto radicular, se añadieron las tres etapas de 'llenar huecos' en 2D a la rutina automática después de un adecuado rebanado del volumen para revelar los tres planos ortogonales (xy, xz y yz). Después de eso, se eliminaron automáticamente pequeños píxeles residuales con la herramienta 'Mantener la región más grande' implementada en el complemento MorphoLibJ (Legland & Arganda-Carreras 2014), que permite la identificación del componente conectado más grande, eliminando los desconectados (Figura 1d). A partir de este punto, solo se utilizaron especímenes con un solo conducto radicular (configuración de conducto tipo I de Vertucci). El volumen de interés (VOI) se estableció desde la unión cemento-esmalte hasta el ápice para medir los parámetros de AR y volumen del conducto radicular. El AR se define como la relación del diámetro mayor al menor y se calculó en cada sección transversal a partir de la aposición de una elipse que mejor se ajusta al conducto radicular utilizando el complemento Shape Descriptors del software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji; Figura 1e). Los resultados de AR adquiridos en todas las secciones se graficaron (Figura 1f) para describir las variaciones de la geometría 2D del conducto a lo largo de la raíz. Los conductos con AR cercano a 1 presentan una forma redondeada, mientras que los valores de AR superiores a tres indican una forma de conducto ovalado o alargado. El volumen (en mm3) se calculó como el volumen del conducto binarizado dentro del VOI utilizando la herramienta Objects Counter (software FIJI/ImageJ). También se crearon modelos tridimensionales (3D) de la raíz y el conducto radicular de cada espécimen utilizando el software CTAn v.1.18.8 (Bruker microCT) y se evaluaron cualitativamente desde vistas bucal y proximal con el software CTVol v.3.3 (Bruker microCT; Figura 1g). Después de eso, se realizó la asignación de muestras en pares anatómicos. Primero, se crearon subgrupos de dientes de acuerdo con el volumen del conducto radicular con un rango de variación máxima de 2 mm3. Se determinó con la ayuda de una prueba estadística adecuada (prueba de alfa de Cronbach) que indicó una homogeneidad muy alta de los datos (0.968) cuando las muestras fueron categorizadas dentro de esta variación máxima de volumen. Además, se comparó la geometría 2D de todo el conducto radicular, representada por la curva gráfica de AR (Figura 1f). Los dientes categorizados dentro del mismo rango de volumen de conducto y que mostraban curvas gráficas similares fueron reagrupados. Finalmente, se examinó el aspecto morfológico 3D de los conductos radiculares (Figura 1g) en estos grupos y los especímenes se asignaron en dos grupos de dientes emparejados anatómicamente (n = 20) basados en volumen similar, gráficos de AR y representaciones 3D de los conductos radiculares. Dos operadores experimentados verificaron de forma independiente estos parámetros antes de la distribución de muestras.

Después de asignar todas las muestras a los tres grupos experimentales, los dientes seleccionados en los grupos 1 y 2 también fueron escaneados y reconstruidos con el dispositivo de micro-CT SkyScan 1173 (Bruker microCT) siguiendo los mismos parámetros utilizados en el grupo 3. Luego, se obtuvieron los valores de AR en cada sección transversal, así como el volumen y la configuración 3D de los conductos radiculares de las muestras de los grupos 1 y 2 y se utilizaron para la comparación. Un diagrama de flujo detallado de la metodología se muestra en la Figura 2.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de regresión bivariada de Pearson correlacionando los valores individuales de AR de cada par. El coeficiente de correlación obtenido para cada par se utilizó para estimar la fuerza de la coincidencia del par junto con las longitudes de las raíces siguiendo la regla general de la fuerza de las correlaciones y se categorizó como muy fuerte (0.9–1.0), fuerte (0.7–0.9), moderada (0.5–0.7), débil (0.3–0.5) o negligible (0–0.3; Cohen 1988). Luego, se compararon los coeficientes de correlación entre los grupos para verificar la similitud de su fuerza respecto a los métodos utilizados para formar muestras emparejadas. Debido a que se observó una distribución en forma de campana para los coeficientes de correlación, se realizó un procedimiento ANOVA de una vía seguido de una prueba HSD de Tukey para comparaciones por pares. Además, se calculó el tamaño del efecto de cada método utilizando eta al cuadrado (g2). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statistical Package for Social Sciences (SPSS v.24; SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) con un nivel de corte para la significación adoptado en el 5%.

Resultados

La Tabla 1 muestra los coeficientes de correlación de cada par de dientes emparejados utilizando los tres métodos de muestreo. El método de micro-CT (grupo 3) mostró un 100% de las muestras calificadas como fuertes (80%) o muy fuertes (20%) en cuanto a los valores de AR. El análisis del método radiográfico (grupo 2) reveló una fuerte correlación en dos pares (20%), pero la mayoría de las muestras tenían coeficientes de correlación débiles (30%) o despreciables (30%). Usando el método de aleatorización (grupo 1), solo un par (10%) fue calificado con una correlación muy fuerte y dos pares (20%) con una correlación fuerte, mientras que el 50% alcanzó tasas débiles o despreciables. Las pruebas post hoc de ANOVA de un solo sentido de Tukey’s HSD encontraron una diferencia significativa en los coeficientes de correlación alcanzados por el método de micro-CT en comparación con los otros grupos (P = 0.000), mientras que no se detectó diferencia entre los coeficientes de correlación de los pares radiográficos y aleatorizados (P > 0.05). Los cálculos de Eta-cuadrado (g2) demostraron un tamaño del efecto muy alto en el grupo de micro-CT para la selección de pares (0.99) y tamaños del efecto más bajos en los métodos radiográfico (0.67) y aleatorizado (0.66). Las Figuras 3, 4 y 5 ilustran los resultados obtenidos de muestras representativas emparejadas en cada grupo.

Discusión

El principal desafío en la creación de grupos experimentales bien equilibrados para estudios comparativos en endodoncia son las variaciones en la anatomía intrincada que pueden existir en un grupo aleatorio de dientes. Por lo tanto, un objetivo importante de los experimentos de laboratorio ex vivo debe ser crear un método factible capaz de superar la variación interna inherente en los dientes humanos naturales (Versiani et al. 2013a). Antes del desarrollo de la propuesta actual, se realizó una búsqueda en la literatura para identificar los métodos más comúnmente utilizados para crear muestras de dientes emparejados en estudios experimentales en endodoncia. Básicamente, estos métodos tenían como objetivo asignar muestras a grupos experimentales de acuerdo con sus características anatómicas. Se observó que algunos estudios adoptaron un punto de la raíz, generalmente a 5 mm del ápice anatómico, y midieron el ancho del conducto radicular en direcciones bucal y proximal, siguiendo la metodología de Wu et al. (2000), para determinar su forma (Tinoco et al. 2014, Teixeira et al. 2015, Lee et al. 2019). En otros estudios, los especímenes se asignan del mismo grupo de dientes mediante aleatorización (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019), mientras que algunos de ellos adoptaron una combinación de métodos radiográficos y aleatorizados para formar pares (Ruckman et al. 2013, Bernardes et al. 2016). Recientemente, algunos estudios comenzaron a utilizar parámetros anatómicos específicos identificados mediante un escaneo de micro-CT para emparejar muestras (Versiani et al. 2013b, Johnsen et al. 2016, Versiani et al. 2016b, Johnsen et al. 2017, 2018). De hecho, la necesidad de explorar un protocolo científico adecuado de selección y emparejamiento para su uso en estudios comparativos en endodoncia fue planteada recientemente por Xu et al. (2016) en su propuesta oportuna y adecuada de utilizar premolares contralaterales para proporcionar consistencia de referencia. Contrariamente a Johnsen et al. (2017), encontraron relativamente pocos pares de premolares contralaterales con simetría anatómica. Sin embargo, en concordancia con Johnsen et al. (2017), encontraron que los dientes contralaterales tenían mejor simetría que los dientes no emparejados. La investigación futura debería explorar si la similitud de los dientes no emparejados seleccionados y emparejados a través de la propuesta actual de usar micro-CT para el emparejamiento es comparable con los premolares contralaterales. Sin embargo, la disponibilidad de dientes premolares contralaterales con ápices maduros extraídos de pacientes más jóvenes que se someten a tratamiento de ortodoncia puede ser limitada. El presente estudio se basó en un gran material humano ex vivo de 1708 incisivos mandibulares. Los dientes pasaron por un estricto proceso de selección para crear dos grupos anatómicamente emparejados basados en métodos de micro-CT y radiográficos y un grupo asignado por aleatorización, con cada grupo consistiendo en 10 pares de incisivos mandibulares. El estricto método de selección de un gran repositorio de dientes junto con un cálculo adecuado del tamaño de muestra a priori permitió la posibilidad de demostrar qué grupo tenía los mejores pares experimentales de referencia bien equilibrados al evaluar estadísticamente cuán fuerte es la similitud entre la forma interna del conducto radicular entre los pares, basado en las correlaciones de los valores AR transversales.

Los bajos coeficientes de correlación obtenidos tanto de los métodos radiográficos como de aleatorización en el presente estudio demuestran que los métodos de aleatorización y emparejamiento radiográfico no pudieron superar la variación biológica inherente en la anatomía del conducto radicular. Por lo tanto, se rechazó la hipótesis nula. Estos resultados demostraron claramente cómo los estudios comparativos endodónticos que utilizan métodos de selección y emparejamiento poco sofisticados requieren un tamaño de muestra mayor para mostrar diferencias reales y estadísticamente significativas. De hecho, un aumento en el tamaño de la muestra probablemente conducirá a una mayor precisión, ya que las diferencias individuales importarán menos, pero puede llegar a un punto donde el efecto sobre la precisión sea irrelevante (Souza 2014). Debe señalarse que las consideraciones éticas y económicas también son incentivos importantes para no tener tamaños de muestra más grandes de lo necesario. Por lo tanto, grupos emparejados y bien equilibrados pueden proporcionar tamaños de muestra más pequeños con suficiente poder para ofrecer resultados fiables. De hecho, el efecto que tiene el emparejamiento de la muestra inicial en la reducción del tamaño de la muestra ha sido demostrado previamente con resultados notables en la investigación ósea (Banse et al. 1996, Barker et al. 2005).

La metodología presente abre la puerta al uso futuro de métodos de coincidencia 3D y recuperación de objetos (Hilaga et al. 2001, Osada et al. 2001, Tangelder & Veltkamp 2008) con capacidades de aprendizaje profundo o redes neuronales artificiales (Hilaga et al. 2001, Ekert et al. 2019, Krois et al. 2019). Tales capacidades incorporadas en una interfaz amigable y semi-automatizada permitirían una selección rápida in silico de dientes con la morfología de conductos radiculares deseada, como conductos de forma ovalada, y luego recolectar las muestras físicamente de un biobanco de dientes disponible para una multitud de diferentes experimentos comparativos endodónticos con alta validez interna. El novedoso método de micro-CT presentado aquí elimina eficazmente el efecto confuso que las variaciones anatómicas en la morfología de los conductos radiculares pueden tener sobre los resultados en diseños experimentales emparejados. Esto tendrá implicaciones inequívocas para la distribución de muestras en grupos experimentales con el fin de mejorar el diseño de estudios comparativos en endodoncia.

Conclusión

El uso de Micro-CT pudo proporcionar un mejor control del efecto confusor que las variaciones anatómicas en la morfología dental pueden tener sobre los resultados en experimentos con diseño emparejado.

Autores: G. De-Deus, M. Simões-Carvalho, F. G. Belladonna, M. A. Versiani, E. J. N. L. Silva, D. M. Cavalcante, E. M. Souza, G. F. Johnsen, H. J. Haugen & S. Paciornik

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